Zwiefalten liegt im Bundesland Baden-Württemberg, am Rande der Schwäbischen Alb, auf halber Strecke zwischen Stuttgart und Bodensee. Der geschichtsträchtige Ort ist umgeben von weitläufigen Naturlandschaften und bildet den südlichen Zipfel des Landkreises Reutlingen, auf einer Höhe von 540 m NN. Zudem gehört Zwiefalten als einer der 29 Städten und Gemeinden zum Biosphärengebiet. Namensgeber des Ortes sind die beiden Bäche Zwiefalter-Aach und Kessel-Aach, die in Zwiefalten zusammen laufen. 
Zu dem ehemaligen Klosterort gehören acht Teilgemeinden, die zwischen 1938 und 1975 eingegliedert wurden.